一、适用场景
乳胶微球表面带有羧基功能基团，可通过EDC介导的化学反应与含有氨基的蛋白或多肽形成酰胺键，实现蛋白与微球的共价偶联。
适用条件:
- 蛋白稳定性高、不易变性；
- 蛋白含氨基数量较少；
- 操作简便，适合大规模生产。
二、基本原理
1.反应机制：
乳胶微球表面的羧基先与 EDC 反应生成活化的酯中间体，再与蛋白上的伯氨基反应生成酰胺键，实现共价偶联。
2.反应环境：
最佳反应 pH 为4.5–6.0（弱酸性环境）。
3.注意事项：
若蛋白同时含多个氨基和羧基，过量 EDC 可能导致蛋白交联失活，可使用羧基乳胶微球两步法共价法偶联蛋白调整方案。
三、注意事项
1. 缓冲体系：
禁用含氨基的缓冲液（如Tris缓冲液），推荐使用MES缓冲体系。
2. EDC适用规范:
- 防潮处理：使用前将EDC试剂瓶置于干燥器中升温至室温至少 30 分钟，避免水汽进入。
- 现用现配：EDC 水溶液半衰期短，需临用前配制。
3.抗体预处理：
- 抗体需不含 BSA 等蛋白类稳定剂及 Tris 等氨基缓冲盐，若含此类成分，需通过离心脱盐、超滤纯化去除。
- 高比例甘油可能影响偶联效率，建议预先去除。
四、基本流程（1 mg 蛋白偶联至 10 mg 微球）
1. 配制缓冲液
- 反应缓冲液（R Buffer）：50 mM MES，pH 5.0（分出 2 mL 冰浴冷却）。
- 封闭缓冲液（B Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA。
- 储存缓冲液（S Buffer）：50 mM HEPES，pH 7.4，1%（w/v）BSA，05%（w/v）Proclin® 300。
2. 微球预处理
- 将微球分散液混匀并平衡至室温，按固含量取 10 mg 微球至 2 mL 圆底离心管，用 R Buffer 稀释至1% w/v固含量。 例：若微球固含量为 10% w/v，取 1 mL 分散液 + 0.9 mL R Buffer；若为 5% w/v，取 0.2 mL 分散液 + 0.8 mL R Buffer。
3. 蛋白孵育
- 加入 1 mg 蛋白，颠倒混匀后，于 25℃混匀仪孵育 30 分钟。
4. 配制 EDC 溶液
- 称取 10–20 mg EDC 固体，用冰浴 R Buffer 溶解至浓度10 mg/mL（≈52 mM）。
5. 加入 EDC 溶液
- 按羧基总量的 5 倍摩尔比加入 EDC 溶液，充分混匀。 计算示例：若微球羧基密度为 100 μEq/g，10 mg 微球含羧基 1000 nmol，需 EDC 1500 nmol，对应 52 mM 溶液体积为 30 μL。
6. 反应与清洗
- 25℃混匀仪反应 2–4 小时，结束后 5000×g 离心 10 分钟（若未完全沉淀，增大离心力或延长时间）。
- 弃上清，加 5 mL R Buffer 重悬沉淀，重复清洗 3 次。
7. 封闭反应
- 加 5 mL B Buffer 初步重悬微球，冰浴下用探头式超声破碎仪（功率 200 W，超声 5 s / 间隙 5 s，总时长 10–15 分钟）充分打散。
- 25℃混匀仪封闭反应过夜。
8. 储存
- 离心弃上清，加 5 mL S Buffer 超声打散，4℃保存备用（离心转速和时间需根据微球粒径调整）。
五、常见问题
Q1：如何选择合适粒径的微球？
- 线性范围优先：选择小粒径微球（比表面积大，偶联抗体量多）。
- 灵敏度优先：选择大粒径微球（凝集时粒径变化显著，浊度信号高）。
Q2：如何判断微球是否完全打散？
- 方法：将微球用去离子水或 R Buffer 稀释至 1% w/v（粒径＞200 nm时稀释至 0.05% w/v），测定 570 nm 吸光度（A0）。
- 对比：包被蛋白后，稀释至相同浓度测定吸光度（A1）。若 A1接近或略高于 A0，说明已打散；若A1远高于A0，可能为不可逆凝集，需降低微球浓度、调整EDC用量或改用两步法。
