一、技术原理与优势
在生物偶联领域，借助水溶性的 1 – 乙基 – 3-[3 – 二甲基氨基丙基] 碳二亚胺（EDC）对羧基进行活化，能够促使蛋白质与羧基化微球表面通过共价键结合。此反应会生成活性中间体 ，该中间体可与伯胺（作为亲核试剂）迅速反应，进而形成稳定的酰胺键。不过，EDC 反应生成的活性中间体稳定性欠佳，容易被水水解，水解后会再生羧基。为解决这一问题，在反应中引入 N – 羟基磺基琥珀酰亚胺（Sulfo-NHS），它能与活性中间体作用，形成更为稳定的 Sulfo-NHS 酯中间体。该中间体与伯胺反应速度虽慢，但最终能生成稳定的酰胺键。
两步法共价偶联方案具有显著优势，尤其适用于同时含有羧基和伯胺基团的分子（如蛋白质）的偶联。由于能形成更稳定的 Sulfo-NHS 酯中间体，所以在添加蛋白质之前可去除过量的 EDC，这样就能避免蛋白质上羧基被活化，降低蛋白质交联的可能性。此外，该方法还便于进行缓冲液交换，有助于提高偶联产率。此方案既适用于高密度（COOH>100μeq/g）的羧基改性微球，也适用于低密度（COOH<100μeq/g）的羧基改性微球。
二、关键操作要点与注意事项
（一）试剂与微球预处理
- 试剂储存与配制
- EDC 需储存于 – 20°C 的干燥容器中，使用前要使其平衡至室温。EDC 对水分极为敏感，若出现潮湿或结块现象，则不可使用，且 EDC 溶液需现用现配。
- Sulfo-NHS 溶液同样要现用现配。
- 所有试剂在使用前都应平衡至室温。
- 微球重悬与分散
- 为使微球重悬更顺利，应尽量让微球颗粒保持松散状态。不同尺寸微球对应的离心力与时长如下：
- 2μm 微球：28,500×g，离心 9 分钟。
- 3μm 微球：19,300×g，离心 7 分钟。
- 4μm 微球：14,200×g，离心 7 分钟。
- 5μm 微球：14,200×g，离心 5 分钟。
- 在洗涤步骤之间，务必将微球完全重悬，特别是在配体偶联之前。可先用移液器吸头反复吹打微球沉淀物，打碎大块团聚物，必要时进行超声分散。
- 浸入式超声波探头是将微球重新悬浮至单分散状态的最有效方式，而吸头吹打、涡旋混合和水浴超声通常效果不够理想。
- 超声处理时要避免样品过热，若有需要，可将试管浸入冰水中进行超声。
- 从外观上看，正常的微球溶液应呈略带 “乳白色”，这表明微球聚合情况良好。还可在 400 倍放大倍数下评估微球团聚程度，单分散微球在该倍数下难以看到，只能看到朦胧的微球 “海”，而团聚的微球则很容易观察到。
- 制备缓冲液和洗涤微球时，需使用 Milli-Q® 纯水，以防止污染物影响实验。
- 抗体浓度需根据特定测试要求进行优化。对于昂贵的抗体，若数量难以达到最佳摩尔比，可添加非特异性蛋白质（如牛丙种球蛋白或 BSA）来占据剩余反应位点。
- 为使微球重悬更顺利，应尽量让微球颗粒保持松散状态。不同尺寸微球对应的离心力与时长如下：
（二）缓冲液选择
在 pH4.5 至 7.2 之间，使用 EDC 和 Sulfo-NHS 进行活化效果最佳。因此，通常优先选用 pH 为 6 的 MES（2-(N – 吗啉代) 乙磺酸）缓冲液进行活化反应。需要注意的是，活化缓冲液中不应含有伯胺或羧基，因为它们会与活化反应竞争，磷酸盐和醋酸盐缓冲液也会降低 EDC 的反应性。MES 可用作偶联缓冲液，若需进一步优化条件，也可选用其他不同 pH 的缓冲液。
三、两步法偶联实验方案
（一）实验材料与设备
- 微球：羧基聚苯乙烯微球。
- 缓冲液
- 活化 / 偶联缓冲液：50mM MES，0。
- 封闭缓冲液：50mM Tris，0，0.5%（w/v）酪蛋白。
- 试剂：EDC、Sulfo-NHS、乙醇胺。
设备：Eppendorf – 5430 离心机（带 FA – 45 – 24HS 转子）、Hielscher Ultrasonics – UP50H 紧凑型实验室均质机。
（二）操作步骤
- 微球洗涤和活化
- 将 100μL 微球（10% w/v 固含量）分装到低蛋白结合的 Eppendorf 管中，加入 1mL 活化 / 偶联缓冲液并充分混合。需注意，活化 / 偶联缓冲液的组分不应含有游离羧基、伯胺基或巯基，以免干扰偶联反应。
- 按照合适的离心条件对微球进行离心（具体离心条件如前所述），倒出上清液，重复洗涤步骤两次。洗涤过程中，要确保微球在步骤之间完全重悬，必要时可使用超声探头分散，还可在显微镜下检查微球分散情况。
- 最后一次洗涤后，将微球重悬于 1mL 活化 / 偶联缓冲液中，确保微球分散良好。
- 使用前立即准备活化试剂，制备 200mM EDC 溶液和 200mM Sulfo-NHS 溶液。
- 向 1mL 洗涤过的微球中快速加入 24μL 200mM EDC 溶液和 240μL 200mM Sulfo-NHS 溶液，在室温下涡旋混合并在转盘上孵育 30 分钟。
- 孵育结束后离心沉淀微球，倒出上清液，用 1mL 活化 / 偶联缓冲液洗涤微球并充分混合，再次离心沉淀微球，重复洗涤步骤两次。
- 将微球重悬于 700μL 活化 / 偶联缓冲液中，在添加抗体 / 配体前，需确保微球分散良好，必要时进行超声分散。
- 抗体偶联
- 用活化 / 偶联缓冲液制备浓度为 2mg/mL 的抗体溶液。
- 根据每克微球 60mg 抗体的包被浓度，在 700μL 微球中加入 300μL 抗体（2mg/mL），彻底混合，此时总液体体积为 1mL（最佳包被浓度需根据具体情况研究）。
- 在室温下于旋转混合器上将上述悬液混合5 小时。
- 对于 1mL 1% 的微球，添加 30μL 乙醇胺（在通风橱中操作），涡旋并在旋转混合器上混合 30 分钟以封闭微球。
- 按照正确的离心速度旋转试管沉淀微球，倒出上清液（可选：保留上清液用于 BCA 分析蛋白质含量）。
- 将微球重悬于 1mL 封闭缓冲液中，在室温下，在转盘上超声处理并混合至少 2 小时，也可在室温下搅拌过夜。
- 再次离心沉淀微球，倒出上清液，添加 1mL 封闭缓冲液，必要时通过吸头吹打和超声处理重悬微球，重复离心和洗涤步骤两次。
- 最后一次洗涤步骤后，除去上清液，加入 1mL 封闭缓冲液，此时微球含量为 1% w/v，通过吸头吹打和超声处理重悬微球（可选：在显微镜下检查微球分散情况），将悬浮液储存在 4°C 下，建议在 5 天内使用，偶联产物的储存稳定性需单独评估。
四、常见问题与解决方案
| 问题现象 | 可能原因 | 解决措施 |
|---|---|---|
| 使用前微球聚集 | 储存或操作过程中微球发生团聚 | 使用前涡旋并超声分散微球 |
| 结合过程中或结合后的微球聚集 | EDC 加入方式不当、蛋白量不足、离心或洗涤操作问题 | 缓慢添加 EDC，加入后充分混合微球，降低微球浓度至 0.5%；增加蛋白浓度，尝试其他偶联缓冲液，对样品进行超声处理打散团聚体；注意充分重悬沉淀，降低离心速度或时间，更剧烈吹打沉淀，增加超声处理时间和 / 或强度，减少微球用量；添加少量表面活性剂（如 0.025% SDS） |
| 抗体或配基与微球的结合量低 | EDC 失活、Sulfo-NHS 中间体水解、蛋白量不足等 | 使用新鲜的 EDC，使用前立即准备 EDC 和 Sulfo-NHS，增加包被浓度，羧基活化后立即加入蛋白，避免加入带有竞争性基团的蛋白或其他组分，更改偶联缓冲液种类和 / 或 pH |
| 包被重复性不好 | 操作过程中混合不充分或试剂不新鲜 | 在每个步骤中将微球悬浮液充分混合，使用新鲜试剂 |
| 偶联抗体后的微球非特异性吸附高 | 封闭剂选择不当、封闭反应时间不足等 | 使用替代封闭剂（BSA、甘氨酸、酪蛋白、鱼皮明胶），增加封闭反应时间，在淬灭步骤中减少乙醇胺的量，减少包被蛋白的量，尝试使用具有较高羧基电荷密度的微球，解决微球团聚问题（参考解决方案 2） |
